一、原理 本試劑盒采用固相酶聯免疫吸附elisa原理，通過黃曲霉毒素b1(afb1)抗原和曲霉毒素b1(afb1)抗體，待測抗原的競爭免疫反應，以及酶的催化顯色反應來檢測afb1，優點是靈敏度高，特異性好，操作簡便，結果易判讀，適用于食品、飼料及相關原料中afb1的定量檢測。 二、試劑盒技術指標 試劑盒靈敏度：0.1 ppb 回收率： 谷物/飼料中afb1回收率 95%±15% 變異系數：批內變異系數三、試 劑 盒 組 成 1．微量測試孔： 96t/8孔 2．標 準 液×6瓶：（1 ml/瓶） 0 ppb 0.05 ppb 0.15 ppb 0.45 ppb 1.35 ppb 4.05 ppb 3．抗體工作液 7 ml 3．酶標記物 12 ml 4．底物緩沖液 7 ml 5．底物液　 7 ml 6．終止液 7 ml 7．20倍濃縮洗滌液 50 ml 加蒸餾水后稀釋到1000 ml。 四、樣本前處理步驟 實驗準備：配制60 %甲醇水溶液（v/v，60：40）和20 %甲醇水溶液（v/v，20：80）。 注意：請精確配制上述溶液，以免影響檢測的準確性。 1 . 脂肪含量低的固體樣品（如大米、玉米、小麥和飼料等） 1、稱取5 g 粉碎樣品于100 ml帶塞三角瓶內，準確加入25 ml 60%甲醇水溶液。 2、將加入了甲醇水溶液的樣品放入振蕩器內（或用手強力振蕩），充分振蕩3 min后，用濾紙過濾，收集濾液。 3、取濾液2 ml，加入6 ml 20 %甲醇水溶液，混勻，用whatman 1號濾紙過濾，此為樣品待檢液。 2．醬油、醋 1、稱取5 g樣品于25 ml小燒杯中，用10 ml蒸餾水將試樣轉移到125 ml分液漏斗中，加入25 ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。 2、放出下層三氯甲烷層，取5 ml于20 ml蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 ml 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。 3、取溶解液2 ml，加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 3．食用油（如菜油、麻油、色拉油、花生油等） 1、稱5 g油樣于25 ml小燒杯中，用20 ml石油醚或正乙烷分次將試樣轉移至125 ml分液漏斗中，準確加入25 ml 60%甲醇水溶液溶液，加塞輕輕振搖5 min，靜置分層，放出下層60%甲醇水提取液。 2、取提取液2 ml，再加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 4．酒類 1、稱取5 g樣品于125 ml分液漏斗中，加入25 ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。 2、放出下層三氯甲烷層，取5 ml于20 ml蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 ml 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。 3、取溶解液2 ml，再加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 5．花生 1、樣品去殼粉碎，稱取5 g于100 ml具塞三角瓶中。加入25 ml 60%甲醇水溶液和20 ml正**），振搖10 min，用whatman 1號濾紙過濾。 2、收集濾液于125 ml分液漏斗中，靜置分層后放出下層60%甲醇水提取液。 3、取提取液2 ml，再加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，再用whatman 1號濾紙過濾，此為樣品待檢液。 6．月餅、桃酥、花生醬等 1、稱取5 g粉碎樣品于125 ml具塞三角瓶中，準確加入25 ml 60%甲醇水溶液和20 ml正**）加塞震蕩10 min，過濾，收集濾液于分液漏斗中，靜置分層。 2、待下層甲醇水溶液澄清后，放出甲醇水溶液于另一三角瓶中。吸取10 ml甲醇水提取液于125 ml分液漏斗中，加入20 ml三氯甲烷，加塞輕輕振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 ml于20 ml蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 ml 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。 3、取溶解液2 ml，再加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 7．面粉、飼料濃縮料 1、稱取5 g樣品于125 ml具塞三角瓶中，準確加入25 ml 60%甲醇水溶液加塞震蕩10 min，過濾，收集濾液。 2、吸取10 ml濾液于125 ml分液漏斗中，加入20 ml三氯甲烷，加塞振搖3 min，靜置分層。放出下層三氯甲烷層，取10 ml于20 ml蒸發皿中，65 ℃水浴通風揮干。揮干冷卻后，準確加入5 ml 60%甲醇水溶液，將蒸發皿中的凝結物充分溶解。 3、取溶解液2 ml，再加入6 ml 20%甲醇水溶液，混勻，此為樣品待檢液。 注意： 1、某些樣品待檢液(如花生等)久置會影響檢測結果的準確性，為保證檢測的準確性，樣品提取后請即時檢測。 2、 若樣品待檢液不立即檢測，請將其存儲于棕色玻璃瓶內，2-8 ℃避光保存。 3、 試劑盒在使用前，請將試劑盒內所有試劑放到室內溫度（20-25 ℃）進行溫度平衡；試劑用完后立即將其放置回2-8 ℃冰箱內保存。 4、 在每個步驟操作時，速度要快，不要將板孔暴露在空氣中時間過久，避免酶標板變干。未用完的酶標板需密閉于自封帶內，防止受潮且避光保存于2-8 ℃冰箱內。 5、 溫育時，需避光，建議將酶標板置于濕盒內(在有蓋容器內放置一塊平整濕紗布)進行溫育。 五、操作步驟： 1．將試劑盒從冷藏環境中取出并將所需試劑從試劑盒取出，置室溫（20-25 ℃）平衡30 min以上, 注意每種液體試劑使用前均須搖勻。 2．按需要取出微孔條及板架，將不用的微孔板重新密封，保存于2-8 ℃，不要冷凍。 3．加標準品/樣本50 μl /孔，然后加抗體工作液50 μl /孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板，室溫下環境反應40 min。 4．洗板4-5次，每次浸泡30 s，拍干。 5． 加入100 μl酶標記物應用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應20分鐘。 6．棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的濃縮稀釋液，輕輕振蕩，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復4次。 7．顯色：每孔加入底物緩沖液50 μl，再加底物液50 μl，輕輕振蕩混勻，室溫環境下避光顯色10 min。 8．測定：每孔加入終止液50 μl，輕輕振蕩勻，設定酶標儀于450 nm處（在20 min內讀完數據），測定吸光度值。 六、結果判定 以標準品百分吸光率為縱坐標，以黃曲霉毒素b1(afb1)標準品濃度（ng/ml）的半對數為橫坐標，繪制標準曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數即為樣本中黃曲霉毒素b1(afb1)的實際濃度。 七、注意事項 1．室溫低于20 ℃或試劑及樣本沒有回到室溫（20-25 ℃）會導致所有標準的od值偏低。 2．洗板拍干后應立即進行下一步操作。 3．混合要均勻，洗板要徹底，否則會出現重復性不好的現象。 4．反應終止液為2 m硫酸，避免接觸皮膚。 5．將不用的微孔板放進自封袋重新密封; 標準物質和無色的發色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6．不要使用過了有效日期的試劑盒，不要使用不同批號試劑盒中的試劑。 7．顯色液若有任何顏色表明變質，應當棄之，0標準的吸光度值小于0.5時，表示試劑可能變質。 八、儲藏條件和保質期 儲藏條件：試劑盒于2-8 ℃ 保存，不要冷凍。 保 質 期：該產品有效期為1年，生產日期見包裝盒。

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