1. 原理 本試劑盒采用間接競(jìng)爭(zhēng)elisa方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的孔雀石綠結(jié)晶紫和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競(jìng)爭(zhēng)孔雀石綠抗體，加入酶標(biāo)記物后，用tmb底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物孔雀石綠結(jié)晶紫的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較可得出相應(yīng)孔雀石綠結(jié)晶紫的含量。 2. 試劑盒組成 （1） 酶標(biāo)板： 96 t/8孔 （2） 標(biāo)準(zhǔn)品液:（1.0 ml/瓶）0 ppb、0.05 ppb、0.15 ppb、0.45 ppb、1.35 ppb、4.05 ppb。 （3） 酶標(biāo)記物： 1瓶（12 ml）。 （4） 抗體工作液： 1瓶（7 ml）。 （5） 底物緩沖液： 1瓶（7 ml）。 （6） 底物液： 1瓶（7 ml）。 （7） 終止液： 1瓶（7 ml）。 （8） 20倍濃縮洗液：1瓶（50 ml）加蒸餾水稀釋到1000 ml。 （9） 1 mg/ml標(biāo)準(zhǔn)品液：（0.2 ml）。 （10） 提取液a （50 ml） （11） 提取液b （50 ml） 3. 需要但試劑盒中不提供的器材和試劑 （1）設(shè)備 …微孔板酶標(biāo)儀(450 nm) …均質(zhì)器 …振蕩器 …離心機(jī) …各種量程的微量移液器 （2）試劑 …蒸餾水 …環(huán)已烷 5. 儲(chǔ)存條件 （1） 2-8 ℃保存，切勿冷凍。　 （2） 將不用的酶標(biāo)板放進(jìn)原袋中重新密封。 （3） 酶標(biāo)記物和顯色劑對(duì)光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。 6. 樣品處理 （1） 魚/蝦樣品的準(zhǔn)備（稀釋倍數(shù)10） 先將魚肉勻質(zhì)后，稱取0.5 g樣品，加入500 μl的0.125 mol/l(ph4.5)乙酸緩沖液，200ul的0.25g/ml鹽酸羥胺，300ul的0.05mol/l對(duì)甲苯磺酸，震蕩15分鐘使之成勻漿，12000rpm離心5min，然后取上清用pbst稀釋5倍，用作elisa檢測(cè) （2） 水質(zhì)樣品（稀釋倍數(shù)1）離心后取50μl作elisa分析。 7. 免疫分析時(shí)試劑的準(zhǔn)備 （1）注意事項(xiàng) a）使用之前將所有試劑平衡至室溫。 b）使用之后立即將所有試劑放回2-8℃。 c）在使用中不要讓微孔干燥。 d）eia分析的重復(fù)性，很大程度上取決于洗板的一致性，仔細(xì)按照推薦的洗板順序操作是eia測(cè)定程序中的要點(diǎn)。 e）在所有恒溫孵育過(guò)程中，避免光線照射，用蓋板膜蓋住微孔板。 （2）濃縮洗滌液使用前應(yīng)根據(jù)所需量進(jìn)行20倍稀釋，即按1ml濃縮洗滌液加入19ml蒸餾水的比例進(jìn)行稀釋。 8. 標(biāo)準(zhǔn)樣品配制方法： （1）用稀釋好的洗液將1mg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品液稀釋1000倍，變成1000ng/ml，振蕩混勻。 （2）準(zhǔn)備5個(gè)1 ml瓶子，其中一個(gè)加入1000 μl洗液，其余的分別加入600 μl洗液。 （3）在1000 μl洗液瓶子中先吸出4.05 μl的洗液，然后加入4.05 μl的1000 ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，使其濃度為4.05 ng/ml，作好記號(hào)； （4）再?gòu)?.05ng/ml的瓶子中吸出300 μl加入其中一個(gè)600 μl洗液的瓶子中，使其濃度為1.35 ng/ml，混勻，作好記號(hào)； （5）再?gòu)?.35 ng/ml的瓶子中吸出300 μl加入其中一個(gè)600 μl洗液的瓶子中，使其濃度為0.45 ng/ml，混勻，作好記號(hào)； （6）再?gòu)?.45 ng/ml的瓶子中吸出300 μl加入其中一個(gè)600 μl洗液的瓶子中，使其濃度為0.15 ng/ml，混勻，作好記號(hào)； （7）再?gòu)?.15ng/ml的瓶子中吸出300 μl加入其中一個(gè)600 μl洗液的瓶子中，使其濃度為0.05 ng/ml，混勻，作好記號(hào)。 9. 測(cè)定程序 （1）將標(biāo)準(zhǔn)品、樣品所需微量反應(yīng)板（均需2個(gè)平行試驗(yàn)）放在反應(yīng)架上。 （2）加入50μl的標(biāo)準(zhǔn)液或處理好的樣品到各自的微孔板中。 （3）加入50μl已稀釋的抗體應(yīng)用液加入微量反應(yīng)板，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，室溫下反應(yīng)20分鐘。 （4）棄去孔中液體，并將微孔板剩余殘液在吸水紙上拍干。每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。 （5）加入100μl酶標(biāo)記物應(yīng)用液到微孔板中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后， 室溫下反應(yīng)15分鐘。 （6）棄去孔中的液體，并在吸水紙上拍干，每孔注滿稀釋好的洗液，輕輕振蕩，放置2分鐘，棄去孔中液體，并在吸水紙上拍干，重復(fù)5次。 （7）加底物緩沖液50μl，再加入底物液50μl，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后，在室溫避光處孵育10分鐘。 （8）加入50μl終止液到微孔板中，混合好在450nm處測(cè)量吸光度值，在加入停止液后10分鐘內(nèi)讀取光度值。 10. 結(jié)果 以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對(duì)應(yīng)的濃度，乘以其對(duì)應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中孔雀石綠實(shí)際濃度。 11. 測(cè)定技術(shù)指標(biāo) （1） 靈敏度： 孔雀石綠檢測(cè)試劑盒的平均檢測(cè)下限約為0.01ng/g（0.01ppb）。 （2） 準(zhǔn)確度（回收率）：回收率為90%±15%。 12. 交叉反應(yīng)活性 孔雀石綠檢測(cè)試劑盒能檢測(cè)孔雀石綠及其相似物，它們的結(jié)合程度不同。以下表格中展示的是相關(guān)值及交叉反映率（%cr），所有濃度均為ppb級(jí)。
種類 % cr
孔雀石綠 100%
隱性孔雀石綠
結(jié)晶紫 100%
隱性結(jié)晶紫

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